抖音风 裸舞 酿酒酵母细胞器区室化合成化学品的有计划进展

跟着合成生物学本领的快速发展，通过代谢工程更动微生物细胞工场坐褥有价值的化合物来替代传统坐褥样式是愈加环保可抓续的不停有规画[1]。字据代谢工程理念，在微生物中开辟代谢阶梯并将代谢通量导向方针居品，可用于生物坐褥多样先进生物燃料、巨额化学品、药物和重组卵白。此外抖音风 裸舞，通过采用一系列灵验交替对代谢阶梯进行优化，举例，限度酶的抒发强度或更动缺陷酶的居品倾向、提高底物的摄入及滚动才能、收缩内源竞争阶梯、重建辅因子均衡体系、缓解或绕过代谢瓶颈，以及减少中间体代谢物和居品的毒性等，大致达到提高方针化合物产量的目标[2-3]。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)看成一种真核模式微生物，其对粗下班业坐褥环境中的低pH、高浸透压、酒精偏执他扼制物等具有较高的鲁棒耐受性，被合计是合成生物学底盘细胞的祈望采用之一。此外，酿酒酵母具有完善的全基因组序列、详实的基因凝视资源和方便的基因操作样式，这也促进了酿酒酵母代谢工程更动的发展。现在，许多生物合成阶梯一经在酿酒酵母细胞质中开辟并取得不俗的跨越，举例酒精，青蒿酸、东谈主胰岛素、肝炎疫苗、法呢烯和异丁醇等[4-16]。

酿酒酵母细胞内具有复杂的膜系统，当合成方针居品所需的前体底物、酶和辅因子等内源性资源不屈衡地散播在不同的细胞器区室中时，细胞器结构会形成一些不利的因素，导致特定化合物的合收效能偏低。举例，异源代谢阶梯的代谢物跨膜转运效能较低和部分代谢物不成跨膜输送、细胞质中前体供给不及以及关系酶过于分散等因素严重影响了方针阶梯的代谢效能。固然提高关系酶的抒发量、假想会通卵白以及东谈主造卵白支架等政策在一定程度上大致进步居品合收效能，但是，前体供给不及等问题依然莫得得到灵验不停[17]。况且，跟着代谢工程变得越来越复杂，更长和更复杂的异源代谢阶梯导入酿酒酵母细胞质中，与自然细胞功能发生串扰的可能性加多，也使细胞的代谢包袱加大[18-20]。同期，异源代谢阶梯也未免会产生对细胞孕育不利的中间体代谢物或(和)方针居品[21-22]。利用多样细胞器的功能特征不停这些封闭代谢通量的问题，是酿酒酵母代谢工程更动的新的关注点[23-24]。细胞中存在多样功能不同的细胞器和细胞结构，包括线粒体(mitochondria)、过氧化物酶体(peroxisome)、高尔基体(golgi apparatus)、内质网(endoplasmic reticulum， ER)、脂滴(lipid droplets， LDs)、液泡(vacuole)和细胞壁(cell wall)，它们结构复杂，每种细胞器都具有私有的里面环境以及特定的代谢阶梯与功能(图 1)。将代谢阶梯靶向细胞器中大致充分利用某些特定细胞器中不成转运出的缺陷前体物，加多酶和中间体代谢物的局部浓度，不错改善细胞质中合成方针化学品的前体物供应不及或异源酶及中间体代谢物浓度不及的弱势，使代谢通量和通路效能得到提高[25-26]。代谢阶梯的区室化，还大致减少通过其他阶梯销耗中间体代谢物，改善异源阶梯有毒中间体代谢物或居品对细胞形成的负面影响[2， 21， 27-29]。另外，细胞器之间的协融合物资交流关于区室化更动也口舌常着急的，各个细胞器的动态协调也能提高居品的生物合成。通过代谢阶梯区室化的政策有望进一步提高方针化学品的产量，表 1追究了比年来通过酿酒酵母细胞器区室合成化学品的有计划实例，并于文中综述了关系有计划进展。

1 线粒体区室合成化学品 1.1 线粒体的结构与功能

线粒体基质由两层膜包裹，与细胞质内环境比拟，具有更高的pH值、更低的氧浓度和更高的氧化还原电位，可通过三羧酸(tricarboxylic acid， TCA)轮回和氧化磷酸化的经由，产生多数的能量物资，是细胞的能源车间[68]。此外，线粒体还参与多种化合物的生物合成经由，如乙酰辅酶A、支链氨基酸、血红素、脂质、丙酮酸、铁硫(Fe-S)簇、NADH、NAD+、黄素腺嘌呤二核苷酸和α-酮异戊酸，这能为许多化合物的合成提供缺陷前体代谢物和氧化还原辅因子[7， 69]，对居品的高效合成至关着急。

1.2 线粒体中合成以乙酰辅酶A为前体的化学品

乙酰辅酶A是中心碳代谢的着急中间代谢物，亦然糖代谢流向脂类分子合成的节点，这也当然成为脂肪酸繁衍物和萜类化合物等多种高值化学品的前体代谢物[70]。在细胞器中乙酰辅酶A的产生阶梯有3条，一是在线粒体中丙酮酸脱氢酶复合物催化丙酮酸形成乙酰辅酶A[68]；二是在线粒体中乙酰辅酶A水解酶催化琥珀酰辅酶A和乙酸底物，将琥珀酰辅酶A的辅酶A基团转念到乙酸，形成乙酰辅酶A[71]；三是在过氧化物酶体中脂肪酸β-氧化产生乙酰辅酶A。在酿酒酵母中，乙酰辅酶A的散播是高度区域化的，主要散播在细胞质、线粒体、过氧化物酶体和细胞核中，且不同区室的乙酰辅酶A的浓度离别较大，据报谈其在线粒体中的含量是细胞质中的20–30倍[72]。但是乙酰辅酶A不成跨膜转运的特色，导致不同区域内不成相互穿梭利用[73]。利用线粒体中乙酰辅酶A的灵验交替，是径直在线粒体中构建下流代谢阶梯，滚动产生不错解放跨膜扩散或通过转运卵白已毕跨膜输送到细胞质的前体或方针居品[21]。举例，利用细胞色素氧化酶等定位线粒体的卵白N端信号肽，将乙酰辅酶A下流的经甲羟戊酸(mevalonic acid， MVA)阶梯或甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate， MEP)阶梯中的全部酶定位抒发到线粒体中，已毕了在线粒体中抒发一些亲脂性萜类化合物(如桧烯、芳樟醇、异戊二烯、角鲨烯)，并利用其亲脂性能解放跨膜扩散的特色，归并在细胞质开辟的一样代谢阶梯，显着进步方针居品的产量[24-25， 27， 31， 74]。利用这种政策，Thomik等[25]通过在细胞质和线粒体共抒发N-截短的桧烯合酶(t34SabS1)，并超抒发线粒体功能卵白Aim25p，使桧烯的滴度达到了154.9 mg/L，是脱手菌株的60倍；Zhang等[31]在线粒体中超抒发法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthetase， ERG20)突变体ERG20F96W/N127W和来自肉桂的芳樟醇合成酶(linalool synthase， CoLIS)的会通卵白CoLIS/ERG20F96W/N127W，并开辟细胞质芳樟醇的合成阶梯，使补料分批发酵的芳樟醇滴度达到23.45 mg/L；Lv等[24]杂交构建二倍体细胞质和线粒体双重代谢菌株，该政策联系于仅使用线粒体或细胞质工程的重组菌株，永诀加多了2.1倍和1.6倍的异戊二烯产量，补料分批发酵坐褥了2 527 mg/L的异戊二烯；Zhu等[27]利用线粒体更动政策坐褥角鲨烯，并在细胞质中超抒发截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMG1)，减轻MVA通路有毒化合物对细胞孕育和角鲨烯坐褥才能的负面影响，使角鲨烯效价达到了21.1 g/L。将某些亲脂性萜类化合物的合成阶梯构建到线粒体区室中，可充分利用区室中的乙酰辅酶A前体底物，使方针化合物的合成相较于细胞质工程得到一定程度的提高。但是，萜类化合物的一些中间体代谢物对细胞是有毒性的，尤其是在线粒体中，大致影响线粒体的平素功能，以致于影响居品的积存。因此，将来有计划需通过愈加致密的代谢调控，进一步提高代谢通量，减少中间居品的积存，以及超抒发或(和)敲除某些缺陷基因，大致减轻有毒化合物对细胞孕育和居品积存的负面影响，为更多的萜类化合物的生物合成提供了政策。

1.3 线粒体中合成以丙酮酸为前体的化学品

丙酮酸是线粒体中TCA轮回平素运转的缺陷前体物。线粒体中丰富的丙酮酸为生物燃料异丁醇和异戊醇的生物合成奠定了基础[34， 75]。通过将合成阶梯的酶基因(包括乙酰乳酸合酶ILV2、酮醇酸还原异构酶ILV5、二羟酸脱水酶ILV3、酒精脱氢酶ADH及α-酮异戊酸脱羧酶KDC)定位到线粒体中抒发，Avalos等[33]利用此政策使菌株合成了635 mg/L的异丁醇并产生了130 mg/L的异戊醇。Hammer等[34]进一步把考究2-酮酸延迟的3种递归酶(LEU4， LEU1， LEU2)定位到线粒体中抒发，加多了异戊醇合成阶梯的通量并灵验地减少了中间体代谢物2-异丙基苹果酸合酶2-IPMS的损耗，使异戊醇产量达到了1 241 mg/L。因此，将齐全的代谢阶梯靶向到线粒体中，大致加多酶和中间体代谢物的局部浓度，绕过竞争通路，减少中间体代谢物的耗损，使居品得到更多的积存。

1.4 不同碳源对线粒体代谢及居品合成的影响

酿酒酵母在进行葡萄糖代谢时，细胞会处于强酵解景色，糖异生阶梯、TCA轮回和乙醛酸轮回中的基因抒发会受到防止，线粒体活性以及细胞孕育也会受到扼制，代谢通量大部分流向发酵居品酒精，该阵势被称为Crabtree效应[76-78]。通过更动参与葡萄糖信号传导的转录因子mth1和RNA团聚酶II介质复合物的亚基med2这2个等位基因不错减轻Crabtree效应，Zhang等[32]有计划发现mth1和med2等位基因的突变体mth1a81d和med2*432y在菌株中会产生协同效应，以缓解Crabtree效应，同期改善细胞孕育，使更多的碳通量引入线粒体并增强能量和线粒体乙酰辅酶A的合成，通过将丙二酰辅酶A还原酶靶向线粒体中抒发，工程菌株利用葡萄糖产生了2.04 g/L滴度的3-羟基丙酸，是野生型菌株的5.4倍。当酿酒酵母利用木糖代谢时，与葡萄糖比拟，木糖代谢经由中细胞举座呈现出Crabtree-negative代谢特征，且木糖代谢中线粒体愈加活跃，通过呼吸测定实验标明：木糖代谢的酵母线粒体活性大致提高多达7.3倍，丙酮酸由胞质到线粒体的输送量和TCA轮回代谢通量也显着增强，为以丙酮酸为前体物的有机酸(醇)类化合物生物合成提供了故意条目[36， 71， 79-80]。通过将异丁醇合成阶梯定位到木糖利用菌株的线粒体中抒发，Lane等[35]使异丁醇的产量达到了2.6 g/L。Zhang等[36]在此基础上进一步敲除bat1 (编码线粒体支链氨基酸转氨酶)、ald6 (编码胞质醛脱氢酶)和pho13 (编码碱性磷酸酶)来优化代谢阶梯，使异丁醇的产量达到了3.1 g/L。基于木糖代谢大致增强丙酮酸参加线粒体的输送量，进而也会提高线粒体中乙酰辅酶A的积存，这故意于提高萜类化合物在线粒体区室中的合成。本课题组通过前期在葡萄糖和木糖共利用酿酒酵母细胞质中合成单萜香叶醇的有计划基础上，通过信号肽将以乙酰辅酶A为前体物到香叶醇全合成阶梯的酶基因定位抒发到线粒体区室内，构建木糖利用酿酒酵母线粒体合成香叶醇菌株。有计划发现，线粒体更动后的菌株香叶醇产量很低且细胞孕育渐渐，细胞的代谢包袱加剧，不利于居品的合成。通过诊治政策将香叶醇合成酶和偏好香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate， GPP)合成酶活性的ERG20WW的会通卵白(tVoGES-GGGS-ERG20WW)以及异戊烯基焦磷酸异构酶(IDI1)定位到线粒体中抒发，联结细胞质中抒发香叶醇合成酶，使菌株孕育得到改善且香叶醇产量得到大幅进步，但仍无法达到细胞质更动菌株的产量，讲解菌株在木糖代谢时线粒体中乙酰辅酶A的通量大部分流向TCA轮回，而流向方针化合物的合成的通量较少。要而论之，通过对酿酒酵母在不同碳源条目下的代谢特征的有计划，发现木糖条目下线粒体活性会得到提高，部分前体代谢物的代谢通量也会增强，将方针化合物的代谢阶梯靶向线粒体中抒发，在一定程度上大致使产量得到提高，但有些化合物的合成与线粒体本人代谢阶梯竞争前体代谢物和能量，例必会影响方针化合物的积存。另外，线粒体里面空间格外拥堵，当引入较长、较复杂的外源代谢阶梯时，可能会导致线粒体代谢压力较大[30]，从而影响平素的生理功能。因此，在将来的有计划中，需进一步对线粒体中代谢阶梯进行优化，提高缺陷酶的催化效能，况且针对不同碳源假想与之匹配的方针居品合成阶梯，使代谢通量尽可能流向方针居品，同期保险线粒体看守其基本生理所需的代谢物和辅因子等，最大规模提高线粒体合成化学品的效能。

1.5 线粒体其他突出环境特色对化学品合成的影响

线粒体区室内具有较高的pH值，这为高pH需求化合物的合成提供了故意时势，举例，淫羊藿苷的生物合成。Wang等[81]在高效坐褥8-异戊二烯山奈酚的酵母菌株的基础上，将对低pH明锐且在酵母细胞质中抒发时会失去活性的异源甲基转念酶(GmOMT2)定位抒发在酿酒酵母线粒体中，催化8-异戊二烯山奈酚生成淫羊藿苷，使重组菌株利用葡萄糖产生了7.2 mg/L淫羊藿苷。

另外，线粒体Fe-S簇卵白是TCA轮回和电子传递链的着急组成部分，它们还参与线粒体内某些氨基酸、血红素、钼辅因子、硫辛酸和生物素的合成[82]。有有计划发现，线粒体中Fe-S簇提供了一个合适的环境来合成固氮酶生物合成的前体甲硫氨酸酶(S-adenosylmethionine enzyme， NifB)[37]。NifB在固氮酶生物合成中占有着急的地位，NifB催化8Fe-9S-C簇形成NifB-co，它组成了3种固氮酶类型的活性位点辅因子的中枢。Burén等[37]将固氮酶基因转念到酿酒酵母线粒体中抒发，使细胞在有氧条目下，淫民导航产生NifB，该有计划为已毕在真核生物中固定N2提供了可行有规画。

2 过氧化物酶体区室合成化学品 2.1 过氧化物酶体的结构与功能

氧化物酶体是由单层膜包裹并含有产生H2O2的氧化酶和降解H2O2的过氧化氢酶的细胞器，它的大小和数目字据孕育条目而动态变化。氧化物酶体的膜结构对许多分子量低于700 Da的小分子物资具有浸透性，并对分子量较大的溶质产生樊篱。氧化物酶体不错容纳一定量的疏水性化合物参与许多代谢反应，包括脂肪酸β-氧化、乙醛酸轮回和甲醇代谢，以及关系联的生物合成经由[40， 43， 83]。过氧化物酶体的脂肪酸β-氧化大致产生乙酰辅酶A，是许多化合物合成的前体物。过氧化物酶体NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase， IDP2和IDP3)，大致为过氧化物酶体提供氧化还原景色，知足生物合成经由对NADPH的需求[84]。由于过氧化物酶体膜对NADPH和乙酰辅酶A不可浸透，依靠大致定位过氧化物酶体基质的信号肽Pts1p和Pts2p，以及定位到过氧化物酶体膜的信号肽mPTS，可将代谢阶梯灵验引入和定位到过氧化物酶体[43， 85]。

萝莉抖音 2.2 过氧化物酶体中合成萜类化合物

过氧化物酶体的脂肪酸β-氧化产生的乙酰辅酶A抖音风 裸舞，是萜类化合物合成的有益要素，引发了在过氧化物酶体区室合成萜类化合物的有计划吝惜。Dusséaux等[1]将MVA阶梯和一些单萜化合物合成酶定位抒发到过氧化物酶体中，凯旋在过氧化物酶体中合成了香叶基二磷酸繁衍化合物，包括香叶醇、(R)-(+)-柠檬烯、反式异胡椒烯醇、单萜吲哚生物碱的前体8-羟基香叶醇和大麻素前体大麻二酚酸。并在半连气儿补料分批发酵条目下产生了5.5 g/L香叶醇和2.6 g/L (R)-(+)-柠檬烯。通过对过氧化物酶体生物发生因子基因pex30、pex31、pex32和过氧化物酶体吞吃受体基因atg36的单一或多重缺失的收尾透露大致加多过氧化物酶体的数目，联结超抒发截短的α-防止卵白征询bul1，可将E3泛素贯穿酶(RSP5)与其底物贯穿起来进行泛素化，防护转运卵白降解，提高酿酒酵母细胞对香叶醇的耐受性，使香叶醇滴度得到进一步提高[38]。Zhang等[39]将MVA阶梯和α-葎草烯合酶通过增强型过氧化物酶体信号肽ePTS1靶向定位抒发于过氧化物酶体中，联结细胞质中α-葎草烯合成阶梯，使重组菌株产生了160 mg/L的α-葎草烯，与细胞质工程菌株比拟，α-葎草烯的产量加多了2.5倍，并在5 L生物反应器中补料分批发酵取得了1 726.78 mg/L滴度的α-葎草烯。Liu等[40]在过氧化物酶体中合成角鲨烯，通过超抒发idp2和idp3加多NADPH向过氧化物酶体的转运、超抒发ant1 (编码过氧化物酶体腺嘌呤核苷酸转运卵白)加多ATP的供应，改善过氧化物酶体中角鲨烯合成，并杂交构建二倍体细胞质和过氧化物酶体双重代谢菌株，使角鲨烯滴度达到了11.00 g/L。过氧化物酶体的脂肪酸β-氧化产生的乙酰辅酶A、辅因子和能量等，以偏执大小和数目不错字据孕育景色进步履态诊治，加多居品的存储空间，为萜类化合物的合成提供了故意条目。

2.3 过氧化物酶体区隔有毒化合物

在化学品合成经由中，异源卵白质的负荷和对细胞有毒性的某些代谢物亦然提高方针化合物产量所需要濒临的不毛。过氧化物酶体与其他细胞器不同，即使里面代谢阶梯总计被破碎，也不会对细胞孕育产生不利影响，使之更故意于分隔有毒的化合物[19]。Sibirny等[43]利用信号肽ePTS1将有毒的去甲克劳林合成酶(nocloline synthetase， NCS)定位抒发到过氧化物酶体中，达到改善菌株孕育的目标，同期利用过氧化物酶体膜的脾气，允许小分子底物和居品大致从过氧化物酶体中扩散流出，使苄基异喹啉生物碱滴度提高了47%。过氧化物酶体细腻的分隔有毒物资的才能，也为其他有毒化合物的合成提供了采用。

2.4 过氧化物酶体合成其他类化合物

除了合成萜类化合物除外，利用脂肪酸β-氧化产生的乙酰辅酶A还不错促进黄酮类化合物(2S)-柚皮素的合成。Zhang等[41]超抒发脂肪酸β-氧化阶梯缺陷的过氧化物酶体增殖和游离脂肪酸转运阶梯卵白(Pex11p)、酰基辅酶A氧化酶(fatty-acyl coenzyme A oxidase， FOX1)、羟酰基辅酶A脱氢酶/烯酰基辅酶A水合酶(3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase and enoyl-CoA hydratase， FOX2)和乙酰辅酶A酰基转念酶(peroxisomal oxoacyl thiolase， FOX3)，加多了过氧化物酶体脂肪酸β-氧化前体物的供给，进一步加多乙酰辅酶A的供应，促进(2S)-柚皮素的产生，在葡萄糖补料分批发酵条目下，菌株(2S)-柚皮素滴度从更动之前的703.53 mg/L提高到了1 129.44 mg/L。过氧化物酶体亦然脂肪酸降解的区室，而降解居品恰是滚动脂肪酸繁衍物的底物。Sheng等[42]将脂肪酰基辅酶A还原酶(TaFAR)靶向抒发于酿酒酵母的过氧化物酶体中，通过超抒发过氧化物酶体中的结构卵白Pex7p和乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase， ACC1)，提高靶向过氧化物酶体酶的效能并优化培养基条目，使在补料分批发酵时，中长链脂肪醇产量卓绝1.3 g/L。

过氧化物酶体在利用木糖的工程酿酒酵母菌株坐褥酒精中也阐明着着急作用。Dzanaeva等[44]有计划发现，过氧化物酶体的缺失会裁汰木糖的酒精产量，过氧化物酶体膜卵白基因pex3或编码过氧化氢酶基因cta1的缺失也会封闭酒精坐褥。而超抒发过氧化物酶体膜卵白Pex34p，使过氧化物酶体的大小增大，提高了滚动木糖坐褥酒精的效能，使酒精产量达到了8 g/L，是亲本菌株的1.4倍。将来，通过改善前体物和辅因子的供应、优化卵白质输入机制、限度特异性自噬降解经由将进一步改善方针居品的滴度，过氧化物酶体区室化更动是酿酒酵母生物合成化学品的一种格外有前途的样式。

3 内质网更动促进化学品合成 3.1 内质网的结构与功能

内质网是真核细胞中最大的细胞器，是多重联结且芜俚动态散播的膜系统。内质网膜系统收罗遍布所有细胞里面，与其他细胞器关筹划合密切，在信息传递、物资和能量交换经由中饰演着急变装，并践诺多种着急的生物学功能，包括卵白质折叠和转运、脂质合成、囊泡输送及钙离子(Ca2+)储存和开释，以及参与多种信号转导阶梯的调控经由[86-87]。内质网内卵白多要被分泌到细胞外，卵白积存也容易形成内质网威胁，故不合乎在其里面构建代谢阶梯，而内质网内在的一些稳态变化经常对提高化学品合成有积极的敬爱敬爱。

3.2 细胞色素P450酶的抒发

酿酒酵母中，主要位于内质网的能催化羟化、环氧化、脱烷基化、碳-碳偶联、氧化裂解等多种不同反应的“红色全能酶”细胞色素P450酶，在次级代谢物(包括萜类、黄酮类、生物碱、阿片类和酚类化合物)的生物合成中阐明着着急作用[88-89]。举例，Thodey等[45]通过抒发一种细胞色素P450酶，以催化阿片类生物合成阶梯中缺陷中间体代谢物(R)-网碱滚动为清风藤碱，并将可待因还原酶(codeine reductase， COR)靶向内质网膜进行抒发，使吗啡的特异性合成得到提高，并在此基础上使阿片类药物的总滴度达到了131 mg/L；通过细胞色素P450酶的催化可将来自MVA或MEP阶梯的萜类前体物修饰、剪裁和诊治以形成萜类化合物，如三萜皂苷、倍半萜青蒿酸、原东谈主参二醇、酚类三环二萜鼠尾草酸等[90-91]。但是，在酿酒酵母中抒发异源细胞色素P450酶存在一些酶促反应效能较低以及对NADPH细胞色素P450还原酶的依赖性等局限性，况且细胞色素P450酶的超抒发频繁会导致内质网的格外形态和增殖[92-93]。因此，在将来的有计划中，需要进一步长远有计划内质网的生理机制和调控收罗，奋发改善细胞色素P450酶的抒发，减轻对内质网的负面影响。

3.3 彭胀内质网体积提高化学品产量

由于内质网的体积空间是卵白质折叠才能的决定因素，利用内质网体积的彭胀，增强内质网内源性和异源性卵白的合成和折叠才能，大致缓解酶抒发量不及带来的代谢限度并改善细胞色素P450酶的抒发和折叠，不错进一步提高方针化合物的坐褥[94-98]。Arendt等[46]通过敲除磷脂酸磷酸酶(phosphatidic acid phosphohydrolase， PAH1)导致内质网急剧彭胀，促进了三萜类化合物、三萜皂苷以及倍半萜青蒿酸的积存。Kim等[47]超抒发激活脂质生物合成的转录因子Ino2p，促进磷脂合成，从而加多内质网膜的面积，使角鲨烯和原东谈主参二醇产量永诀提高到了634 mg/L和12.1 mg/L，与对照菌株比拟，产量永诀提高了71倍和8倍。Wei等[48]利用相通政策，并超抒发促进卵白质折叠的转录因子Hac1p，激活卵白质折叠关系基因的转录，激活内质网中的未折叠卵白应答，减少内质网彭胀带来的压力，使铁锈醇滴度加多到了36.29 mg/L，并在5 L分批补料发酵中坐褥了75.18 mg/L鼠尾草酸。利用酿酒酵母内质网进行代谢工程，为提高化合物的产量提供了新采用。通过在内质网抒发异源细胞色素P450酶，多种高值化合物可在酿酒酵母中进行合成。通过扩大内质网的体积，部分化学品的合成得到提高，但过度扩大也会对细胞孕育产生负面影响。因此，需要保抓内质网生理景色的沉着性，来提高酵母细胞工场合成方针居品的才能。

4 高尔基体更动提高卵白质分泌抒发 4.1 高尔基体的结构与功能

高尔基体是一个蓦然的、动态的细胞器。在酿酒酵母细胞中，高尔基体呈分散的时势散播，由多个孤独膜联结的池组成，透泄露横向互连、开窗和管状的结构[99-100]。高尔基体是囊泡输送收罗的中心，和内质网协同职责以处理、分选和输送新合成的卵白质和脂质[101]。在卵白质分泌经由中，内质网新合成的分泌卵白被输送到高尔基体，在那儿它们被加工和修饰[102]。加工完成后，货品卵白在反式高尔基收罗(trans-Golgi network， TGN)中被分拾遗输送载体囊泡中，完因素泌抒发[99]。但是，比较而言酿酒酵母的卵白分泌才能较差，导致异源卵白胞外抒发的水平相对较低，况且异源卵白的积存也会对细胞形成压力[103]。

4.2 优化基于高尔基的卵白质分泌阶梯提高居品的合成

通过改善包被着外壳卵白复合物Ⅱ (coat protein complex II， COPII)和外壳卵白复合物I (coat protein complex I， COPI)的囊泡之间的端正耦合，协调内质网和高尔基体之间的双向囊泡输送，以及加强内质网到高尔基体和高尔基体到质膜经由中的卵白质转运方式，是改善酿酒酵母异源卵白质坐褥的一种政策。通过超抒发内质网外周卵白Sec16p，加强内质网到高尔基体之间的顺走输送，不错促进COPII囊泡的形成，加多剧组卵白的分泌[104]。Bao等[49]在超抒发sec16基因的菌株中超抒发ADP-核糖基化因子GTP激活卵白Glo3p来改善COPI囊泡介导的逆走输送，加多了酵母中异源卵白α-淀粉酶的分泌。Nielsen[14]超抒发从高尔基体到细胞膜的囊泡输送以及内源性卵白滚动酶分泌的Sec1/Munc18 (SM)卵白(SEC1)刺激从高尔基体到胞吐作用的囊泡输送增强了胰岛素前体、α-淀粉酶和内源性卵白质滚动酶的分泌，并超抒发从内质网到高尔基体的囊泡会通的SM卵白(SLY1)改善了内质网到高尔基体的输送，进一步提高了α-淀粉酶的产量，使菌株在葡萄糖限度补料分批发酵中产生了238 mg/L α-淀粉酶，比对照菌株提高了16%，且重组胰岛素前体菌株产生了84 mg/L的胰岛素前体，比对照菌株提高了34%。通过对核内体到高尔基体输送的修饰，不错在加多卵白质分泌的同期灵验地减少了卵白质的淹留，进一步提高异源卵白的分泌。Huang等[50]敲除参与高尔基体和核内体之间的转运基因vps5和vps17，收尾透露减少了α-淀粉酶在细胞内淹留及增强了胞外分泌量，更动后的菌株α-淀粉酶的产量较对照菌株提高了2倍多，在补料分批发酵中α-淀粉酶的产量达到了2.5 g/L，况且在发酵经由中α-淀粉酶保留在细胞内的比例不到10%。

此外，高尔基体的形态、数目的大小不错通过基因更动进行更动，但是这些表型的更动对卵白质分泌的影响机制尚不明晰。其他机制包括细胞内降解或卵白质合成加多也可能影响卵白质的淹留和分泌[50]。在将来的有计划中，基于异源卵白分泌阶梯的改善以偏执他提高卵白质分泌的政策，酿酒酵母将在异源卵白质的坐褥中阐明弘大后劲。

5 脂滴更动促进亲脂性化合物的合成 5.1 脂滴的结构与功能

脂滴是一种具有私有结构的动态细胞器，发源于内质网，由疏水性中性脂质、三酰基甘油和甾醇酯组成，被内质网繁衍的磷脂单层膜包围，参与疏水性中性脂质的生物合成和解析以及磷脂和甾醇的合成，在脂质和细胞能量代谢中阐明中枢作用[29， 105-111]。酿酒酵母看成一种非产油酵母，固然对亲脂性化合物的产生才能有限，但脂滴看成细胞内脂质的储存室，大致将亲脂性化合物储存在其中，这关于提高亲脂性化合物的合成有很大的启发[112]。

5.2 加多脂滴容量提高化合物产量

在脂滴中脂质储存水平会受到脂滴储存空间的限度，通过细胞类型、养分可用性和代谢景色调度脂滴的脂质组成、大小和数目，可使脂滴容量加多，来容纳更多的亲脂性化合物[55， 113]。举例超抒发二酰基甘油酰基转念酶(diacylglycerol acyltransferase， DGA1)，大致加多细胞内脂滴的数目，提高α-香树脂醇和角鲨烯的产量[51-52]，最终在补料分批发酵中产生了1 107.9 mg/L α-香树脂醇；使角鲨烯产量达到了255.11 mg/L。在超抒发dga1基础上，Ma等[53]进一步超抒发acc1、脂肪酸去饱和酶基因ole1和敲除内质网中一种膜卵白基因fld1 (Seipin)，改善脂滴的主要因素三酰基甘油的积存，促使脂滴变大，容量加多，进而使工程菌的番茄红素产量达到了70.5 mg/g DCW，较原高产菌株提高了25%，补料分批发酵番茄红素产量达到了2.37 g/L和73.3 mg/g DCW。通过加多脂滴的大小和容量，使其大致容纳更多的亲脂性化合物，加多细胞的承载才能，利用此政策不错联结其他细胞器更动，进一步加多一些亲脂性化合物的积存，举例线粒体或过氧化物酶体工程更动相联结，来提高亲脂性萜类化合物的合成。

5.3 调度脂质代谢提高化合物产量

脂滴在脂质代谢中具有着急作用，脂质代谢收罗的调度不错灵验地影响亲脂性化合物的生物合成。举例Sun等[54]超抒发全局调度因子等位基因upc2-1、甾醇酰基转念酶基因are2和acc1，增强脂肪酸的生物合成阶梯并扩大脂滴储存容量，使菌株麦角甾醇产量加多到了40.6 mg/g DCW，比脱手菌株高4.2倍，采用两阶段补料政策进行高密度细胞发酵，使菌株麦角甾醇产量达到了2 986.7 mg/L和29.5 mg/g DCW。Zhao等[55]超抒发甾醇酰基转念酶基因are1和are2，使细胞内甾醇酯水平提高。况且磷脂酸磷酸酶基因pah1、dpp1和lpp1的缺失，提高了磷脂水平。联结这两种政策，加多了细胞内类胡萝卜素的积存，使β-胡萝卜素产量达到了8.98 mg/g DCW，比拟于脱手菌株提高了2.4倍。此外，Bu等[56]利用外源添加2 mmol/L油酸的政策，减少了β-胡萝卜素与三酰基甘油生物合成对前体物的竞争，显耀改善了三酰基甘油的代谢，并联结代谢工程样式，使菌株产生了11.4 mg/g DCW和142 mg/L的β-胡萝卜素。在加多脂滴的大小和容量的基础上，进一步提高脂质代谢通量，大致使亲脂性化合物的积存得到进一步提高。

5.4 脂滴中调度阶梯代谢通量

关于复杂的代谢阶梯，除了调度、优化脂质的合成阶梯以及使脂滴容量加多外，将代谢阶梯区室化更动来调度代谢通量，大致缓解亲脂性化合物合成中的抒发瓶颈。Shi等[29]使用信号肽Pln1p将细胞色素P450酶原东谈主参二醇(protopanaxadiol， PPD)合酶(PPDS)靶向脂滴进行抒发，使底物达马烯二醇-II滚动为PPD的效能提高了394%，在以PPD为底物坐褥PPD型皂苷东谈主参皂甙化合物K (PPD-type saponin ginsenoside compound K， CK)的菌株中，CK滴度达到了5 g/L。Guo等[57]将erg2 (编码C-8甾醇异构酶)、erg3 (C-5甾醇去饱和酶)、dhcr24 (Δ24-脱氢胆固醇还原酶)、erg25 (编码C-4甲基甾醇氧化酶)、erg26 (编码C-3甾醇脱氢酶)和erg27 (编码3-酮甾醇还原酶)基因靶向脂滴进行抒发，提高了中间代谢物的滚动效能，使甾醇7-脱氢胆固醇产量从领先的187.7 mg/L提高至360.6 mg/L。通过将部分代谢阶梯靶向到脂滴中，大致加多酶和中间体代谢物的局部浓度，提高了中间代谢物的滚动效能，使居品得到更多的积存，为异源亲脂性化合物(如自然橡胶[114]等)的合成提供了念念路。

6 液泡更动提高化学品合成 6.1 液泡的结构与功能

酿酒酵母液泡是细胞中酸性最强的细胞器，pH值在5–6.5之间，是碱性氨基酸、多聚磷酸盐、Ca2+和许多金属离子的主要储存时势，区室内含有多种水解酶，可降解卵白质、核酸和脂质等大分子物资，并能分隔多种有毒物资[115-119]。液泡参与细胞质离子浓度和pH值的稳态调度，看守细胞内浸透压均衡，并在细胞应激反应中阐明着多重作用。当细胞在养分丰富的条目下，大部分氨基酸在液泡中积存，而在养分衰退时，液泡中氨基酸会转运到细胞质中保证细胞孕育[120]。

6.2 优化液泡转运机制提高居品积存

由于液泡是部分氨基酸的主要存储时势，因此液泡的定位抒发政策经常大致赔偿缺陷酶催化才能不及的问题，促进液泡中氨基酸灵验滚动，从而提高前体的利用率及方针居品的积存。张念念琪等[58]利用羧肽酶Y的锚定肽将酪氨酸解氨酶(FjTAL)定位抒发到液泡中，提高了液泡中酪氨酸利用率，使以酪氨酸为前体物合成对香豆酸的产量提高至593.04 mg/L。同期，液泡膜上特定的氨基酸转运卵白对细胞器之间物资的转运阐明着着急作用，优化液泡转运卵白输送机制，不错增强代谢居品的输送和坐褥。Srinivasan等[59]引入植物液泡转运卵白来改善酿酒酵母液泡转运卵白输送机制的限度，提高了托烷生物碱的生物合成，使生物碱莨菪碱滴度达到了30–80 μg/L。进一步发现2种转运卵白AbPUP1和AbLP1能促进液泡输出和细胞对石蕊碱和莨菪碱的再次吸收来加多工程酵母中的托烷生物碱产量[60]。将来自4种不同植物中转运卵白(NtJAT1、NtMATE2、AbPUP1和AbLP1)的抒发联结起来，大致促进细胞器之间通路中间体代谢物的交换，使莨菪碱和东莨菪碱产量永诀达到了480 μg/L和172 μg/L。

现在，大多数有计划是将居品合成的缺陷酶在液泡中定位抒发，并通过浅显优化液泡的转运机制改善代谢居品的输送和坐褥。敬爱敬爱的是，液泡的大小和数目会跟着细胞外部环境的变化而变化，这故意于液泡通路的感性假想和更动，以期增强液泡合成居品的效能，但关于生物合成的分析和调控机制还需长远有计划。此外，液泡酸性内环境的特色可为pH明锐的化学品提供祈望的合成时势。为了进一步提高液泡合成关系化学品的才能，优化液泡对居品转运经由偏执与其他细胞器之间的协调是今后有计划的着急方面之一，并联结液泡的特色针对性地采用合成特定化学品。

7 细胞壁工程强化化学品的生物合成

细胞壁是一个复杂的细胞结构，在细胞孕育和分裂经由中决定了细胞的样式和齐全性。细胞壁占酿酒酵母细胞干重的15%–30%，由含有β-1， 3-葡聚糖、β-1， 6-葡聚糖和几丁质的内层和含有甘雨糖聚卵白的外层组成[121-122]。内层主要考究细胞壁的机械强度，而外层则起到樊篱的作用，限度细胞内物资流出。细胞壁形成的物理樊篱，是细胞反抗外部环境威胁的第一王人防地，细胞壁齐全性(cell wall integrity， CWI)阶梯的细胞壁赔偿机制不错反馈细胞壁挫伤，看守细胞稳态[123-125]。对细胞壁稳态扰动的细胞壁工程不错提高细胞内方针化学品的坐褥。(1) 增强细胞对扼制物应激反应，提高对某些扼制物的耐受性，减轻毒性化合物对细胞形成的损害。Kahar等[61]通过在有扼制物的培养基中筛选出一株高鲁棒性的菌株，对其有计划发现，参与细胞壁产生的朊病毒转录扼制卵白基因mot3的突变，大致增强酿酒酵母菌株细胞壁的疏水性，引起絮凝反应引发，使菌株鲁棒性得到加强，在含有扼制物的培养基中，24 h销耗30 g/L的葡萄糖，产生了14.5 g/L的酒精。Son等[62]敲除CWI阶梯的缺陷调度因子Ecm33p激活CWI阶梯收复膜刚性，使细胞对高浸透压和高浓度盐离子的耐受性显耀增强，进一步提高角鲨烯坐褥效能，与亲本菌株比拟产量加多了约12%。(2) 破碎细胞壁齐全性，提高卵白分泌抒发，加多了酵母中异源卵白的产量。Li等[63]破碎编码细胞壁甘雨糖卵白基因cwp2，使酿酒酵母中纤维二糖水解酶的产量得到加多。许多有计划发现，使用糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol， GPI)锚定本领在细胞名义抒发功能卵白是构建具有突出功能的酵母细胞的一种很有远景的样式，该本领主要依赖于通过与基因会通的锚定卵白[频繁是GPI-锚定细胞壁卵白(GPI-anchored cell wall proteins， GPI-CWP)]贯穿在细胞壁上抒发靶卵白。Inokuma等[65]使用不同的锚定域Sed1p和Sag1p将外切和内切纤维素酶定位到细胞壁进行抒发，提高了重组菌株的纤维素解析才能，在对预处理后的稻草进行水热和球磨处理，同期糖化和发酵经由中酒精滴度提高了30%。GPI锚定的甘雨糖卵白(covalently linked cell wall protein， CCW12)是酿酒酵母细胞壁结构的着急成，超抒发ccw12大致提高菌株对扼制物的耐受性和细胞壁沉着性。Kong等[64]在利用木糖菌株中超抒发ccw12，更动后的菌株在玉米秸秆水解物中48 h内产生了0.503 g/g总糖或表面值的98.8%的最好酒精产量。在玉米、芒草、玉米芯和小麦秸秆的多样工业水解物中表现细腻，在玉米芯水解物中12 h内的最好酒精产量为0.49 g/g总糖，并对未脱毒的水解物表现出很好的安妥性。但是，与之不同的是Inokuma等[66]有计划发现，在酿酒酵母菌株中共敲除ccw12和ccw14 (编码非酶GPI-CWP)，能使菌株细胞壁厚度加多，并使异源β-葡萄糖苷酶抒发的数目偏执活性比亲本菌株提高约1.4倍，但细胞壁形态变化和异源卵白分泌才能加多的分子机制仍不明晰。

通过主宰细胞壁关系卵白的比例与含量来强化细胞的鲁棒性，对加多酵母菌株中异源卵白和高值化合物的积存有很大的匡助，但现在关系作用机制尚不通晓。至极是卵白类化合物的合成和分泌经由中细胞壁卵白是何如阐明作用的还有待长远有计划。

8 东谈主工合成细胞器的有计划与应用

东谈主工合成细胞器是指不错参与代谢阶梯的东谈主工生物催化隔室，将生物代谢阶梯封装到东谈主工合成细胞器中，是增强生死亡学品坐褥的一种有前途的政策。使用东谈主工合成细胞器不错减少与宿主细胞代谢的不良串扰，并能更好地限度反应环境。基于东谈主工合成细胞器的可编程性意味着它们对代谢物的浸透性和名义结构不错被诊治利于特定的反应。举例，通过假想细胞器孔径的大小和电荷以利于底物的流入和中间体代谢物的流出等[126]。Cheah等[67]利用鼠多瘤病毒样颗粒(murine polyomavirus virus-like particles， MPyV-VLPs)假想出东谈主工代谢纳米区室。并将一种自然不沉着的肌醇加氧酶(inositol oxygenase， MIOX)，拼装进东谈主工代谢纳米区室顶用于坐褥d-葡糖二酸。该有计划是在酿酒酵母中初度展示不错参与代谢阶梯的东谈主工合成细胞器，并标明代谢物不错通过MPyV外壳扩散，尽管抒发的卵白质水平较低，但仍加多了方针居品滴度。东谈主工合成细胞器为酿酒酵母这一着急的生物底盘细胞扩展了体内卵白质支架和分隔器具。而关于一些细胞内特定的反应需要具体诊治东谈主工合成细胞器的结构等一些机制问题还需进一步有计划阐发。

9 瞻望

比年来，跟着对酿酒酵母中不同细胞器的长远有计划，各个细胞器的结构和功能得到了更好的领路。通过细胞器工程合成化学品的缺陷是识别并调度细胞内转运的细胞器膜卵白，通过快速灵验的卵白质转运机制，将代谢阶梯的关系酶径直定位到细胞器中抒发，然后利用多样细胞器私有的功能与丰富的底物，现在多种化学品的生物代谢阶梯一经在酿酒酵母细胞器中构建[18， 127]。随后，利用代谢工程本领进一步对区室中的代谢阶梯以及细胞器的结构进行优化，使酿酒酵母不错高效合成方针化合物，以及一些特定性能得到加强(举例，鲁棒性)。本文通过要点先容了酿酒酵母的多样细胞器的结构、功能以及化学品合成的代谢工程更动政策等，并永诀叙述了不同细胞器的环境特色偏执合乎的化学品种类。举例，线粒体中实足的乙酰辅酶A、丙酮酸等前体物、辅因子和能量等，可为萜类化合物、醇类化合物和其他化合物的生物合成提供故意条目；过氧化物酶体脂肪酸β-氧化产生的乙酰辅酶A、辅因子和能量等，可为萜类化合物、黄酮类化合物和脂肪酸繁衍物的合成提供故意条目，并能灵验地区隔有毒化合物；内质网中抒发异源细胞色素P450酶，对许多化合物的合成至关着急，通过扩大内质网的体积，大致增强内质网内源性和异源性卵白的合成和折叠才能，提高方针化合物的积存；改善高尔基体的卵白质转运方式，不错提高细胞卵白质分泌；加多脂滴的大小、体积和脂质代谢通量，大致提高亲脂性化合物的积存；优化液泡转运机制，改善代谢居品的输送和坐褥，提高方针居品的积存；主宰细胞壁关系卵白来加强细胞的鲁棒性，对加多居品的积存有很大的匡助。固然部分细胞器代谢阶梯通量无法卓绝细胞质阶梯，但可与细胞质形成协同增强的效果，从而举座上提高了方针居品的产量。由于细胞器之间代谢通路的复杂性，以及现代谢阶梯的里面资源散播在由高采用性、不浸透性膜离隔的不同细胞器时，酵母的细胞器结构会给代谢工程带来许多挑战。举例，不同细胞器对不同物资的存储方式不同；对卵白质的定位和数目的了解不及，无法教导通路的构建和优化或导致通路通量不屈衡；有毒代谢物引入缺陷细胞器会影响其平素功能；酿酒酵母有些细胞器是高度动态的，况且跟着孕育条目、碳源、代谢景色、外部环境和其他因素在数目、大小、体积、定位和活性方面发生更动[2]；即使细胞器数目和体积扩大，特定细胞器中的最大卵白质负载可能会变得有限，导致孕育包袱等。为了应酬这些挑战，需要对代谢物输送、辅因子生物合成和输送、定位信号肽采用、细胞器膜的浸透性、各个细胞器的生理学脾气和细胞代谢进行更系统的有计划，以进行合理的阶梯更动[128]。

瞻望将来，固然在酿酒酵母细胞器工程更动合成化学品的有计划中取得了阶段性的效能，但要想显耀提高方针居品的产量抖音风 裸舞，笔者合计将来的有计划场地可注视从如下几个方面议论：(1) 将新的生物合成阶梯靶向细胞器进行抒发时，要充分分析细胞器的特色以及方针居品合成阶梯的特色，了解居品合成阶梯与细胞器之间的优、弱势，奋发提高细胞器与居品之间的匹配性，提高合收效能；(2) 优化代谢阶梯，提高缺陷酶的定位效能和催化效能，尽可能减少细胞区室内的抒发量以减轻可能出现的代谢包袱；(3) 利用基因的动态调控政策，幸免中间体代谢物的过度积存对细胞器形成压力或毒性，从而导致合成阶梯受阻；(4) 跟着对酵母细胞内膜结构偏执对特定底物的转运卵白及关系分子转运机理有计划的长远，针对不同代谢物的高效转运系统将被构建，届时期谢通量也将有大幅进步；(5) 关于长且复杂的居品合成阶梯，有计划多区室的动态协调、交流以进一步提高化学品的生物合成。敬佩跟着异源生物合成阶梯的长度和复杂性连续加多，需要将代谢阶梯的传统假想原则与代谢居品输送因素和非代谢信息相联结，以开释微生物生物制造平台的全部后劲[60]。同期，合成生物学和系统生物学的发展也将驱动酿酒酵母中多样自然居品生物合成的细胞器代谢工程的有计划进度，充分挖掘细胞合成化学品的潜能，最大规模地提高微生物细胞工场的合成才能，为化学品生物合成的工业化坐褥奠定基础。